目前，由于易于獲得和相對較低的成本，動物來源的I型膠原蛋白（例如牛皮、豬皮、鼠尾）仍然是再生醫(yī)學應用的常見選擇。雖然人源和動物來源的膠原蛋白有一些相似之處，但氨基酸組成的細微差異會影響膠原蛋白的理化特性、細胞應答和組織重塑，并最終影響組織和器官功能。此外，動物來源的膠原蛋白可能引發(fā)免疫并發(fā)癥和疾病傳播風險，這也值得注意。
近期的研究報告，使用了美國Humabiologics Inc公司的人體皮膚來源的膠原蛋白——HumaDerm，它是一種應用于組織工程的無異源生物材料。使用人源膠原蛋白可以顯著減少FDA審批相關的監(jiān)管壓力，加快科研成果的臨床轉化。
人源I型膠原蛋白的結構和細胞培養(yǎng)特性
通過SEM成像以定性評估I型膠原蛋白水凝膠的纖維組織結構。牛源及人成纖維細胞和鼠尾I型膠原蛋白水凝膠表現(xiàn)出類似的薄且松散堆積的纖維形態(tài)（圖1A上排）。相比之下，人皮膚來源的I型膠原蛋白表現(xiàn)出的高密度膠原纖維形態(tài)，而人胎盤I型膠原蛋白水凝膠則表現(xiàn)出較低的密度但較粗的纖維?？傊@些結果證實I型膠原蛋白水凝膠中膠原蛋白纖維的組織結構在不同物種、不同組織來源和不同提取方法之間存在很大差異。
通過染色測定法評估接種在I型膠原蛋白水凝膠上的人間充質干細胞 (hMSC)的活力。結果顯示在所有測試條件下都具有高細胞活力（圖1A下排）。
圖1.水凝膠的SEM成像顯示不同組織來源、不同物種和提取方法之間，膠原纖維形態(tài)存在差異。LIVE/DEAD成像表明，隨著時間的推移，hMSC在I型膠原蛋白水凝膠上保持活力?！?】
3D培養(yǎng)和藥物篩選
將Caco-2結腸直腸癌細胞包裹在水凝膠基質（I型鼠尾膠原蛋白和I型人皮膚來源膠原蛋白）中。選擇鼠尾I型膠原蛋白是因為它通常用于癌癥類器官的形成和藥物篩選研究。3D腫瘤細胞團暴露于多種濃度的化療藥物中，如5-氟(5FU)和Regorafenib。這兩種藥物都是治療結直腸癌常用的臨床批準的化療藥物。在第0天、第1天、第4天和第7天對腫瘤細胞團進行ATP活性定量和活/死細胞染色實驗，活/死細胞染色結果與ATP活性數(shù)據一致，表明暴露于1μm Regorafenib或5FU的3D腫瘤細胞團隨著時間的推移具有升高的ATP活性和擴增calcein-AM陽性細胞，而更高的濃度卻得出相反的結果（圖2）。值得注意的是，人皮膚組織來源的I型膠原蛋白培養(yǎng)的3D腫瘤細胞團在ATP活性和細胞活力方面對Regorafenib與5FU的反應表現(xiàn)出更明顯的差異。這些差異可能影響3D腫瘤模型開發(fā)、藥物篩選應用的成功或失敗。
圖2.結直腸癌的LIVE/DEAD可視化3D細胞團的增長情況與之前的定量數(shù)據相互驗證，表明3D腫瘤細胞團在很大程度上以劑量依賴方式對化療藥物作出反應。實驗中，1、10和100 μm濃度給藥后的第1、4和7天，用calcein AM（綠色）和ethidium homodimer-1（紅色）染色的結直腸癌Caco-2 3D細胞團的熒光顯微鏡圖像（n=3）。條件包括瑞戈非尼（上）和5-氟尿嘧啶（下）處理的 I 型鼠尾膠原蛋白和人皮膚來源I型膠原蛋白3D腫瘤細胞團。用calcein AM染色的綠色活細胞，用ethidium homodimer-1染色的紅色死細胞。比例尺1:100 μm?！?】
血管形成能力
比較人源和非人源I型膠原蛋白在SCID/bg小鼠模型中促進體內血管形成和灌注的能力。通過外植體時的檢查，鼠尾或人皮膚來源的I型膠原蛋白水凝膠似乎是高度血管化的（圖3A下排）。植入前和移植后水凝膠重量的測量表明，與大鼠尾I型膠原蛋白相比，人皮膚來源的I型膠原蛋白凝膠在14天內的重量減輕顯著增高（p<0.05），這是一個潛在的低保水能力的指標（圖3B）。福爾馬林固定、石蠟包埋的水凝膠組織切片的H&E染色證實了檢查的結果，并在植入后14天在鼠尾或人源I型膠原蛋白水凝膠中發(fā)現(xiàn)了大量微血管（圖 3C上排）。與人皮膚來源 I型膠原蛋白水凝膠相比，F(xiàn)4/80染色切片的定量表明，小鼠巨噬細胞在I型鼠尾水凝膠中的浸潤明顯更高（圖3C下排，3D）。
圖3.鼠尾I型膠原蛋白和人皮膚來源的I型膠原蛋白水凝膠對體內血管形成的影響。(A)水凝膠植入SCID/bg小鼠模型腹壁前和14天后的照片，比例尺1：5毫米。（B）通過在植入時和外植體后測量水凝膠重量來評估凝膠收縮情況。數(shù)據顯示為均值標準誤差(SEM) (n = 3; p<0.05)。(C)植入后14天水凝膠的代表性H&E圖像，顯示含有水凝膠的鼠尾和人體皮膚來源的I型膠原蛋白支持體內血管形成。F4/80免疫組化分析顯示小鼠巨噬細胞有不同程度的浸潤。插圖代表水凝膠橫截面的低放大率視圖。比例尺1：500 μm。(D) F4/80+染色面積的定量結果表明，在人皮膚來源的I型膠原蛋白的水凝膠中，浸潤程度特別高（*表示p<0.05）。【1】
細胞3D打印
3D生物打印是一種逐層制造技術，生產負載細胞的組織結構，精確控制其幾何形狀及引起細胞反應的生化指標的空間分布。結果表明，6mg/ml的人源膠原蛋白可以獲得高形狀保真度的組織塊，且不需要進一步修飾（圖4（a））。另一方面，使用異源膠原打印的組織結構不穩(wěn)定，并在FRESH支撐浴熔化時塌陷（圖4(a)）。這種結果差異原因在于剪切力的不同，而這種剪切力在FRESH熔化過程中誘導了異源膠原結構體的碎裂。
一個更合理的解釋是，人源膠原蛋白中的超組織纖維狀結構能夠更好地承受剪切力，從而在FRESH支撐浴熔化后保持打印結構的形狀保真度。此外，與異源膠原不同，在FRESH介質中打印具有3mg/ml人源膠原的結構是可行的。細胞活力結果表明，懸浮在人源膠原蛋白生物墨水中的細胞在打印后仍然有活力（圖4（b）和（c））。高細胞活力（即沒有紅色染色）原因在于印刷過程中較低的生物墨水粘度和減少的剪切應力。此外，與第1天相比，第7天的細胞密度明顯更高，這表明細胞在打印的膠原蛋白結構中隨著時間的推移而增殖?？傊?，這些結果表明人源膠原蛋白可用負載細胞的3D生物打印用的有效生物墨水。
圖4.使用人源和異源膠原生物墨水的3D打印結構。(a)使用3mg/mL和6mg/mL膠原蛋白生物墨水打印的網格結構的3D模型和圖像，在從FRESH介質中取出前后，(b) 第1天細胞狀態(tài)，和 (c) 第7天細胞狀態(tài).比例尺1：200毫米。【2】
總結
研究中測試的商業(yè)可用的各種I型膠原蛋白，不同來源具有不同的機械、生化和生物學特性，在開發(fā)再生醫(yī)學療法時應考慮這些特性差異。仍然需要進一步研究以了解不同膠原蛋白和ECM來源的特性。已有數(shù)據表明，與生理和臨床相關的人源皮膚I型膠原蛋白可以用作動物來源膠原蛋白的替代品，以更好開發(fā)再生醫(yī)學療法。
參考文獻
1. Baltazar T, Kajave NS, Rodriguez M,et al. Native human collagen type I provides a viable
physiologically relevant alternative to xenogeneic sources for tissue engineering applications: A comparative in vitro and in vivo study. J Biomed Mater Res. 2022;1‐15. doi:10.1002/jbm.b.35080
2. Schmitt T, Kajave N, Cai HH, Gu L, Albanna M, Kishore V. In vitro characterization of xeno-free clinically relevant human collagen and its applicability in cell-laden 3D bioprinting. J Biomater Appl. 2021;35: 912-923. doi:10.1177/0885328220959162
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Humabiologics.,Inc作為醫(yī)療器械原材料供應商，致力于提供符合ISO13485質量體系規(guī)范的生物材料來滿足客戶的研發(fā)及生產需求，其產品HumaDerm是為數(shù)不多的市售天然人源I型膠原蛋白產品，是許多應用的理想選擇，如2D和3D細胞培養(yǎng)、類器官、動物建模、再生醫(yī)學、生物打印、診斷和篩選、藥理學和許多其他生命科學研究相關應用。
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